Ovary spheroid formation and quality assessment using two different protocols

Abstract: Redan innan födseln fastställs kvinnors fertilitet, som karakteriseras av ett begränsat antal äggblåsor, så kallade folliklar. Beståndet av folliklar minskar naturligt med åldern, samtidigt som kvinnors fertilitet beror på deras steroid- och äggproduktion. Patologiska tillstånd som polycystiskt ovarialsyndrom (PCOS), prematur ovariell insufficiens (POI) och cancer, samt ett flertal livsstils- och miljöfaktorer, kan ha en negativ inverkan på kvinnors fertilitet. Eftersom alla dessa faktorer kan leda till minskad fertilitet, har fertilitetsbevarande tekniker samt assisterade fortplantningstekniker blivit allt mer viktiga. Aktuell forskning gällande regeneration av äggstockar innefattar bildandet av sfäroider och organoider, en ny typ av in vitro 3D-odling, som kan användas för att etablera modell system av olika organ. I denna masteruppsats jämfördes två olika system för 3D-odling, three-layer gradient system (3-LGS) samt Biosilk™, för att bilda äggstockssfäroider baserade på celler från cortex och medulla. I 3-LGS påträffades icke-organiserade cellaggregat, endast från medulla, fram till 25 dagar av odling. Dock resulterade 3-LGS inte i några sfäroider, för varken cortex eller medulla, efter 6 veckor av odling. Därför krävs det fortsatta försök för att kunna dra slutsatser om 3-LGS kan användas för att bilda 3D-kulturer från vuxna äggstocksceller. Däremot lyckades äggstockssfäroider framställas, från både cortex och medulla, med hjälp av Biosilk™ efter sammanlagt 6 veckor av odling. Dessa sfäroider antingen fixerades eller förvarades i -80°C för framtida bulk RNA-sekvensiering eller RNA fluorescerande in situ-hybridiserings (RNA-FISH). Ett RNA-FISH protokoll (RNAscope®) förfinades, för att bättre kunna visualisera äggstocksvävnad samt äggstockssfäroider. Vävnaden snittades antingen på behandlat täckglas eller på mikroskopglas. Då både äggstocksvävnad och Biosilk™ är autofluorescerande, blektes vävnadssnitten olika länge. Dessutom testades olika fluoroforer för att få en så bra signal som möjligt. Slutsatsen var att, vävnad snittad på behandlat täckglas inte genererade i en klarare signal från fluoroforerna som först förväntat. Istället hade vävnaden hög autofluorescens samt antingen vek sig eller föll av de behandlade täckglasen. Möjligtvis skulle RNAscope® protokollet kunna förfinas ytterligare, för att vidare undersöka om användandet av vävnad snittad på behandlade täckglas skulle vara fördelaktigt. Vävnad som blektes längre än vad det ursprungliga RNAscope® protokollet angav hade en lägre autofluorescens. Därav ledde förfiningen av protokollet till att det blev mer anpassat för äggstockssfäroider framställda med Biosilk™. Slutligen, uppvisade fluoroforerna TSA 520, TSA 570 och TSA 650 en skarpare signal än fluoroforerna Fluorescein Tyramide, Cy 3 och Cy 5.