Development of a new quantitative PCR analysis method for HIV-1

Abstract: På grund av planerat tillverkningsstopp av instrumenten som används idag på Octapharma AB, så syftar detta projekt till nyutvecklingen av en kvantitativ PCR analysmetod för detektion av HIV-1 i human blodplasma, genom TaqMankemi. Projektet inkluderade design, testning och utvärdering av olika set av primer och probe sekvenser. För att säkerställa specificiteten hos metoden designades primrarna och proberna för att vara komplementära till olika konservativa regioner av HIV-1:s genom. Primer och probe set:en (P/P) testades både individuellt och kombinerat i spädningsserier och genotypspaneler. Analyserna visade att det inte fanns någon korrelation mellan felmatchning av P/P och referenssekvenser hos subtyper, och detektionsnivå. När P/P testades i kombination hittades falsk-positiva signaler i negativa kontroller (4 falsk-positiva signaler; n= 106). Detta åtgärdades genom att utesluta specifika prober(0 falsk-positiva signaler; n= 152)(p = 0,030, Fisher’s exact test). Kombinationen av primer och prober, med någraprober uteslutna, hade en högre detektionsnivå för HIV-1 subtyper än de individuella set:en (29 positiva prover vs 23.5; n= 64), och lyckadesäven detektera åtminstone ett positivt prov hos varje subtyp A, B, C, D, AE, F, G och H. Avsaknaden av korrelation mellan felmatchning av P/P och detektionsnivå, visar på att orsaken av den suboptimala detektionsnivån av subtyper var inte på grund av antalet felmatchningar mellan primer och probe set:en till målsekvenserna. Den högre specificiteten vid kombination av P/P indikerar även att primrar och prober som riktar in sig på olika regioner avHIV-1 genomet ytterligare ökar specificiteten och detektionsnivån hos metoden.