Isolation of the native chloroplast proteome from plant for identification of protein-metabolite interactions

Abstract: För att kunna livnära en växande population behöver avkastningen på skördar öka. En lösning på dettaär att optimera plantornas fotosyntes, vilket innefattar förbättrad koldioxidfixering. För att lyckas meddet krävs kunskap i hur reglering av nyckelproteiner i kloroplasten går till. Syftet med detta projekt är identifiera möjliga reglerande protein-metabolitinteraktioner i Arabidopsis thaliana. Målproteinerna ärde 11 enzymerna i Calvin-Benson-Basshamcykeln. Metaboliterna som testas är 3PGA, ATP, FBP, GAP, vilka är mellan produkter eller kofaktorer i cykeln; 2PG, som är en produkt av en konkurrerande reaktion i cykeln; och slutligen G6P, citrat och sackaros, vilka är centrala metaboliter i andra viktiga reaktioner i cellen.  Före experimenten med Arabidopsis testades protokollen med spenat.  Som ett första steg isolerades kloroplasterna från blad. När intakta kloroplaster verifierats extraherades proteinerna. Inter-aktioner mellan metaboliterna och proteinerna analyserades med en metod kallad limited proteolysis-small molecule mapping. Denna teknik, vilken kombinerar begränsad proteolys med masspektrometri, detekterade flertalet protein-metabolit interaktioner. I Arabidopsis uppvisade alla enzym förutom FB-Pase, PPE och TIM minst en interaktion. I spenat sågs interaktioner med FBA, GAPDH, PGK, PRK, RuBisCO, TIM och TK. Resultaten visar möjliga reglerande interaktioner, vilka skulle kunna användasför att identifiera flaskhalsar i kolfixeringen. Denna kunskap kan i sin tur utnyttjas för att öka flödet i Calvin-Benson-Basshamcykeln och därigenom förbättra växters koldioxidfixering.