Sortase A coupling of the recombinant partial silk proteins 4Rep-Srt and G-/G5-CT to understand the structure of silk fiber

Abstract: Spindelsilke är ett intressant material på grund av dess biokompatibilitet och därav användning som biomaterial. Det är jämförbart med konstgjorda material när det gäller styrka och elasticitet, och i kombination med biokompatibiliteten, är spindelsilke eftertraktat inom det medicinska området. Sju olika spindeltrådar produceras av hjulspindeln och en kan användas som säkerhetslina vid flykt, och är därav mycket stark och töjbar. Säkerhetslinan består av två proteiner, så kallade stora ampullkörtel spidroiner 1 och 2 (MaSp1 & 2) eftersom de produceras i den stora ampullkörteln i spindeln. Dessa två proteiner är i sin tur sammansatta av tre delar, en repetitiv region i mitten och två icke-repetitiva regioner vid proteinets terminaler, N- och C-terminal domänerna. Att använda spindlar som huvudsakliga producenter av spindeltråd inom forskning är problematiskt och har fått forskare att vända sig till rekombinant produktion för uttryck av proteiner, mestadels i E. coli. Proteinstorleken är en begränsning vid produktion i E. coli, så forskare har uppfunnit ett mindre protein än MaSp som endast består av en mindre del av den repetitiva regionen och C-terminal domänen, så kallad 4RepCT. 4RepCT kan fortfarande bilda spindeltråd under fysiologiskt tillstånd och är biokompatibel. 4RepCT kan funktionaliseras med biomolekyler som kan ändra dess funktion, till exempel genom ett celladhesions motiv från fibronektin, som gör att 4RepCT kan binda till celler. I detta projekt siktar vi på att producera 4Rep-Srt och G-/G5-CT separat innan de kopplas med enzymet Sortase A. Sortase A känner igen en Sortase-tagg (LPXTG) på C-terminalen av ett protein (4Rep-Srt i detta projekt) och kopplar det till annat protein som har 1-5 glyciner på N-terminalen (G-/G5-CT i detta projekt). När proteinerna produceras separat kan G-/G5-CT uttryckas med 13C och 15N före kopplingen, och ge information om vilken del av 4Rep-G-/G5-CT-proteinet som är G-/G5-CT. Genom att känna till proteinets struktur, kan även dess egenskaper och funktioner förstås för att bättre bistå konstruktionen av proteiner för att erhålla biomolekyler med önskade funktioner.