PAMPaR: Parallel Analysis of miRNAs, Proteins and RNAs. Dynamic Profiles of miRNAs, mRNAs and Specific Proteins in Mouse Embryonic Stem Cells Differentiating into Neural Precursors

Abstract: MikroRNA-molekyler (miRNA) är viktiga icke-kodande RNA-molekyler för post-transkriptionell reglering av proteinkodande gener. De har även effekter på många cellulära processer såsom differentiering. De biosyntetiska reaktioner som skapar miRNA involverar proteiner som själva regleras av miRNA. Dessutom kan inte miRNA-uttryck direkt förutsäga mRNA-reglering. Följaktligen kan parallell profilering av miRNA, mRNA och specifika proteiner över en differentieringsprocess leda till nya insikter gällande miRNA-funktion och -reglering. Den här studien utvecklade Parallell Analys av miRNA, Proteiner samt RNA (PAMPaR) för co-profilering i bulk-cellysat av miRNA med small RNA-sekvensering, mRNA med RNA-sekvensering samt utvalda proteiner med proximity extension assay (PEA). PEA-designen avancerades från en tidigare studie i vilken qPCR användes för resultatavläsning till användning av Next Generation Sequencing (NGS). För detta syfte validerades koncentrationer av antikroppar konjugerade till protein-specifika oligonukleotider för att bekräfta antikropps-specificitet för målproteinerna innan PEA-NGS. PAMPaR applicerades på embryonala stamceller från möss (mESCs) som differentierades till neuronala precursor cells (NPCs). miRNA-profilering resulterade i observerade NPC-nedregleringar av medlemmar i pluripotens-relaterade miR-290-familjen och uppregleringar av hjärnrelaterade miR-9 samt let-7f och miR-99a; miRNA involverade i differentiering. mRNA-profilering visade också förväntad NPC-uppreglering av gener involverade i nervcellsdifferentiering och nedreglering av gener involverade i embryonal utveckling. Korrelationsanalys mellan miRNA och mRNA ledde till flera typer av uttrycksmönster; både förväntade som uppreglering av mRNA i NPCs samtidigt som reglerande miRNA nedreglerades, och oväntade som uppreglering av både miRNA och deras mål-mRNA i NPCs. Därför drogs slutsatsen att de starka effekterna på mRNA-uttryck vid differentiering troligare drivs av transkriptionsfaktorer än av förändrade miRNA-uttryck, samt att djupare dataanalyser krävs för fler insikter. Dessutom skulle miRNA och mRNA kunna profileras vid flera tidpunkter under differentieringsprocessen för att detektera gradvisa förändringar. PEA-NGS data genererades för kvantifiering av proteiner involverade i biosyntesreaktioner för miRNA och differentieringsrelaterade proteiner. Dock var inte korrelation till miRNA- och mRNA-uttryck möjlig inom tidsramen för studien. Sammanfattningsvis gav applicering av PAMPaR på mESCs och NPCs insikter i miRNA-medierad reglering under nervcellsdifferentiering. Vidare är PAMPaR ett lovande multi-omics-verktyg som också fungerar som språngbräda för nedskalning av PEA-analyser till encellsnivå.