How much can the cross-linking of chromatographic media affect the porosity?

Abstract: Vätskekromatografi är vanligt förekommande metod för separationer av molekyler inom bioteknik. Det finns inom begreppet vätskekromatografi många olika tekniker och vilken specifik teknik som är mest lämplig för en given separation beror på egenskaperna hos den avsedda målmolekylen. Egenskaper för vilka målmolekyler kan separeras är bland annat storlek, laddning och affinitetsintreaktioner. Porositeten är i den stationära fasen en avgörande egenskap, eftersom porernas tillgänglighet påverkar den stationära fasens tillgängliga yta. Således är förmågan att bestämma porositeten en avgörande aspekt vid tillverkningen av den stationära fasen. Agaros utgör ofta den stationära fasen, på grund av modifieringsmöjligheterna hos polysackaridkedjorna.  Bio-Works Workbeads 40/1000 SEC är agarbaserade pärlor för den stationär fas i storleksutslutningskromatografi. Pärlorna är tvärbundna två gånger för att få tillräcklig styvhet och för att uppnå en önskad fördelningskoefficient. Det första tvärbindningssteget bestämmer strukturen på pärlorna och därmed porositeten, medan det andra tvärbindningssteget försäkrar att pärlorna får tillräcklig styvhet. För produkten Workbeads 40/1000 är de önskade fördelningskoefficienterna mellan 0,2-0,35 för thyroglobulin, 0,62-0,75 för albumin (från äggvita) och 0,85-0,95 för ribonukleas A. För att bestämma förhållandet mellan koncentrationerna av reaktanterna NaOH och allylbromid i den första tvärbindningen och de resulterande egenskaperna hos den stationära fasen (fördelningskoefficienter, styvhet och porstorlek) ändrades koncentrationerna av reaktanterna i den första tvärbindningen. Samtliga resulterande pärlorna med de ändrade koncentrationerna analyserades med hjälp av en ÄKTAexplorer. Pärlornas styvhet bestämdes genom att analysera kraschflödet i den packade bädden. Det fanns inga tecken på några skillnader mellan de tillverkade pärlproverna. De icke-specifika interaktionerna analyserades genom att jämföra fördelningskoefficienterna i en standard PBS-buffert med en hög saltkoncentrationsbuffert. Polaritetsförändringen i den mobila fasen kan påverka de icke-specifika interaktionerna eftersom hydrofobiska interaktioner då främjas. Fördelningskoefficienternas kurvor jämfördes också för att analysera likheter och skillnader för olika proteiner. Skillnader i formen på fördelningskoefficientkurvorna kan innebära att porstorleken inte är den enda bidragsfaktorn till skillnaderna i fördelningskoefficienterna. Därför kan skillnaden innebära effekter av icke-specifika interaktioner och det fanns det indikationer på att vissa icke-specifika interaktioner uppstod mellan proteinerna och agarpärlorna. Det finns dock ingen skillnad mellan de pärlor med många tvärbindningar och de med få tvärbindningar. Porstorleken och porstorleksdistribution bestämdes genom att använda en uppsättning dextran med inverterad storleksutslutningskromatografi.  Efter varje tvärbindningsreaktioner bestämdes antalet bildade tvärbindningar genom titrering med silvernitrat. Det visade sig att koncentrationen av allylbromid hade en större inverkan på de resulterande egenskaperna jämfört med koncentrationen av NaOH. En ökad koncentration av allylbromid visade på ett ökat antal bildade tvärbindningar. Experiment med många bildade tvärbindningar visade sig ha en större porstorlek och högre fördelningskoefficienten jämfört med experiment med lägre mängd bildade tvärbindningar.