Recombinant production of spider silk for enzymatic phosphorylation

Abstract: Ett rekombinant framställt miniatyrspindelsilkeprotein, funktionaliserat med ett Arg-Gly-Asp-motiv som finns i fibronektin, FN-4RepCT, har använts för många olika bioteknologiska tillämpningar, som vävnadsteknik och cellodling, i form av fibrer, filmer och skum. FN-4RepCT kan produceras i Escherichia coli, och det interagerar spontant med sig självt och bildar fibrer under fysiologiska förhållanden. Lite är känt om fiberbildningsprocessen i spindlarna. Studier av larvsilke från nattsländor (Caddisfly) har dock visat att fosforgrupper finns i fibrerna. Många paralleller kan dras mellan spindelsilke och silke från nattsländan, som närvaron av upprepade aminosyrasekvenser som omvandlas till kristallina β-flak med flexibla amorfa regioner emellan. Därför siktar vi i detta projekt på att producera FN-4RepCT, genetiskt modifierat med ett proteinkinas A-fosforyleringsställe, kallat FN-4RepCT-PM2. Fosforyleringsstället finns i β-flakregionen i 4Rep-domänen av proteinet, likt som hos silket från nattsländan. Proteinet utrustades med en HTH-tagg innehållande histidiner för rening genom immobiliserad metalljonaffinitetskromatografi och tioredoxin för ökad proteinlöslighet. För att ta bort HTH-taggen inkorporerades molekylsekvensen för HRV 3C-klyvning (klyver mellan aminosyrorna Q och G). Den molekylära kloningen av proteinets nukleotidsekvensen var framgångsrik och uttrycket och reningen av fusionsproteinet (HTH-QG-FN-4RepCT-PM2) resulterade i ett maximalt utbyte av 2,1 mg/L cellkultur. Klyvningen av HTH-taggen var dock inte idealisk och separationen av det klyvda silkesproteinet från taggen och fusionsproteinet behöver fortfarande optimeras. Den erhållna proteinblandningen (klyvd, fusion och tagg) kunde bilda cirkulära fibrer på 3 timmar. Framtida fosforyleringsstudier bör genomföras och egenskaper undersökas i termer av proteinlöslighet, fiberbildningshastighet och fiberstyrka med och utan metalljoner och sedan jämföras med vanlig FN-4RepCT.