Studier av genetisk bakgrund till nedsatt spermiekvalitet hos berner sennenhundar

Abstract: Syftet med denna studie var att undersöka möjliga ärftliga faktorer till nedsatt spermiekvalitet hos berner sennenhundar i Sverige. I tidigare morfologiska studier av sperma från berner sennenhundar konstaterades att de har ett förhöjt antal svansdefekter jämfört med normalvariation för hundar. Utifrån detta valde vi att undersöka gener involverade i bildningen av spermiens flagell i en kandidatgenapproach. Eftersom det finns få studier inom detta område hos hund valde vi ut kandidatgener som visats orsaka svansdefekter hos möss och människor, dessa var Dynein Heavy Chain 1 (DNAH1) och Armadillo Repeat Containing 2 (ARMC2). Vi begränsade undersökningen till att undersöka exon 73 i DNAH1 och exon 4, 8, 10, 16 & 17 i ARMC2 med PCR och Sangersekvensering från åtta hanhundar av rasen berner sennen. För PCR-sekvensering använde vi genomisk DNA från helblod. Från 91 av totalt 96 PCR-sekvenseringar var resultaten av god kvalitet och kunde analyseras. Från tre individer erhölls specifika PCR-produkter från antingen forward eller reverseprimern, och från en individ erhölls ingen produkt från exon 16 från ARMC2 genen. Inga mutationer som setts i dessa gener hos möss och människor med astenozoospermi kunde ses hos dessa hundar. För att undersöka om det är möjligt att relatera mängden mRNA från utvalda gener till spermiekvalitet från fryst och färsk sperma analyserades färsk och fryst sperma från en beagle samt fryst sperma från en berner sennenhane. RNA extraherades med och utan tillsats av Ribonukleas (RNas) inhibitor och RNA Integrity Number (RIN) värdet med och utan denna tillsats jämfördes. Kvaliteten på RNA isolatet utvärderades med hjälp av en Agilent Tapestation, som bestämmer ett RIN-värde på en skala mellan 1 och 10. I studien erhölls det högsta RIN värdet på 5,8 när färsk sperma analyserades med tillsats av RNas inhibitor. Det lägsta RIN värdet var 2,7 vilket erhölls när fryst sperma analyserades från en berner sennen men som fick RNas inhibitor tillsatt vid analys, och från färsk sperma utan tillsats av RNas inhibitor. Detta var endast en pilotstudie på totalt 3 prover för att utvärdera metodens effektivitet att utvinna RNA från spermier. Vi kontrollerade också kvaliteten på färsk vs fryst sperma för att få information om metodens effektivitet. Ytterligare studier behövs för att finna den genetiska bakgrunden till nedsatt spermiekvalitet hos berner sennenhundar. Slutsatsen från vår studies andra del är att det sannolikt går att optimera RIN värdet från hundspermier genom att modifiera protokollet och att det går att använda RNA från hundsperma för att studera och vidare analysera genuttryck från intressanta gener. Nyckelord: Berner sennen, fertilitet, spermiekvalitet, spermiemorfologi, kandidatgener, DNAH1, ARCM2, RNA