Toward prototyping metabolic pathways in cyanobacteria using cell extracts

Abstract: Cyanobakterier är intressanta mikroorganismer för produktion av biobränslen från solljus, vatten och atmosfärisk koldioxid och anses därför vara potentiella mikrobiella cellfabriker. Men på grund av långsam tillväxt och låg produktion är genteknologi processen intensiv och tidskrävande för cyanobakterier. En alternativ metod till prototypteknik för metabola vägar är att använda cellfri metabolisk teknik där cellysat av överuttryckta enzymer används. I detta projekt försökte vi utveckla en metod för cellfri metabolisk ingenjörsteknik för cyanobakterien Synechocystis PCC 6803 med hjälp av den övre mevalonatvägen som exempelreaktionsväg. Vi började med att utveckla tre fluorescensbaserade metoder för att detektera proteinöveruttryck med hjälp av de tre enzymerna från mevalonatreaktionsvägen. Dessa metoder använde fusering av YFP-proteinet till målproteinet, en delad GFP-reporterprotein eller translationskoppling. Ett av de överuttryckta enzymerna verkade vara giftigt för Synechocystis-celler så flera inducerbara promotorer användes för att försöka uttrycka enzymet. Den högst uttryckande konstruktionen för varje gen valdes ut och proteiner extraherades och blandades i en cellfri metabolisk ingenjörsreaktion. Även om inget mevalonat kunde detekteras med hjälp av gaskromatografi i detta projekt, berodde detta sannolikt på otillräckligt högt proteinöveruttryck av mevalonatgenerna.